北京2022年5月8日 /美通社/ -- 2022年5月2日，陸道培醫院陸佩華教授（第一作者和共同通訊作者）團隊、河北森朗生物科技有限公司（以下簡稱"森朗"）李建強教授（共同通訊作者）團隊（劉瑩，共同第一作者）、北京大學人民醫院黃曉軍教授（共同通訊作者）合作在血液科國際權威期刊Blood（IF=23.63）發表了題為Naturally Selected CD7 CAR-T Therapy without Genetic Manipulations for T-ALL/LBL: First-in-human Phase I Clinical Trial 的研究論文。
急性T淋巴細胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL) 和T淋巴母細胞淋巴瘤(T-cell lymphoblastic lymphoma, T-LBL)是具有高度侵襲性的T系惡性腫瘤。由于正常T細胞和惡性T細胞之間共有的抗原性，目前仍然缺乏針對T細胞惡性腫瘤的獲批CAR-T療法。
CD7在T-ALL/LBL T細胞表面高度表達，是潛在的CAR-T治療靶點。靶向CD7的免疫療法可能會受到T細胞自相殘殺機制（fratricide）的影響。因此，在既往研究中曾采用CRISPR/Cas9基因編輯技術和蛋白沉默表達技術生產靶向CD7的CAR-T細胞。但是，基因編輯技術會使得CD7 CAR-T細胞的生產成本增加。此外，使用患者自體T細胞制造CD7 CAR-T細胞仍然具有一定難度。雖然供者來源或通用型CD7 CAR-T是一種選擇，但尋找合適的供體、異體CAR-T在體內擴增能力及持續時間等問題仍有待解決。
針對上述難題，本研究開展探索，使用了森朗生物研發的患者或供者來源的，無需額外進行CD7基因編輯或蛋白質表達阻斷的"自然選擇（Naturally Selected）"CD7 CAR-T細胞(NS7CAR)的新產品，并在1項針對T-ALL/LBL患者的1期臨床試驗中首次探索了NS7CAR療法在人體內的安全性和有效性。
臨床前研究
研究者使用三種不同的方法制造了靶向CD7的CAR-T細胞并比較它們的功能：1)NS7CAR：通過用7CAR轉導總T細胞，然后對其進行"自然選擇"的細胞培養方式獲得；2)Neg7CAR：由天然存在的CD7陰性T細胞（占CD3+T細胞的3%-10%）用7CAR進行純化和轉導后進行生產；3)KO7CAR：通過將7CAR轉導到使用CRISPR/Cas9RNP敲除CD7基因的總T細胞進行制造。
在2周的培養期間內，NS7CAR的細胞擴增倍數顯著低于Neg7CAR和KO7CAR的擴增倍數；然而，有87.3%的NS7CAR是活細胞，使得進一步研究成為可能。在收獲時，NS7CAR組中平均92.4%的T細胞表達7CAR分子，顯著高于Neg7CAR或KO7CAR（p<0.0001)。在7CAR慢病毒轉導三天后，NS7CAR組中的T細胞發生了從CD7+CAR-到CD7-CAR+的快速而顯著的表型轉變。
一個有趣的發現是，盡管NS7CAR組中的T細胞在體外培養后用流式未檢測到CD7的表面表達，但使用RT-PCR和WesternBlot檢測到了顯著的CD7mRNA和蛋白質的表達。與此同時，在Neg7CAR或KO7CAR細胞中未觀察到CD7mRNA或蛋白質表達。這些結果表明，盡管NS7CAR表達CD7mRNA和蛋白質，但它們在免疫學上是CD7陰性的，并由于CD7CAR的抗原隱蔽/細胞內隔離作用而逃脫了自相殘殺的細胞殺傷機制。這一點在隨后的臨床研究中，在CAR-T回輸后第28天檢測到患者體內NS7CAR中CD7mRNA的表達持續存在而被進一步證實。此外，相比Neg7CAR和KO7CAR，NS7CAR包含較多的CD8+亞群和中央記憶表型亞群。
在體外抗白血病實驗中，NS7CAR和KO7CAR對CCRF-CEM細胞均表現出相當的細胞毒性，并釋放高水平的IFN-γ和TNF-α，但Neg7CAR細胞的相應數值較低。在動物實驗中，在CAR-T注射后的前兩周內，NS7CAR和KO7CAR均可顯著降低小鼠模型中的白血病負擔。這些數據證明了無需額外的基因編輯，直接由7CAR轉導的總T細胞產生有效的CD7CAR-T的可行性。因此，陸道培醫療團隊在1期臨床試驗中使用NS7CAR-T細胞，進一步探索其有效性和安全性。
臨床研究
‖研究設計
本研究是1項開放、單臂的1期臨床研究，目的是評估NS7CAR對CD7+R/R T-ALL或T-LBL患者的安全性和療效。入組標準包括年齡在2至65歲之間的患者，既往至少接受過兩線治療后失敗，且CD7表達≥80%的患者。在NS7CAR輸注后的第28天后，根據醫生的考量和患者的意愿，允許進行鞏固性異體造血干細胞移植。
‖患者基線數據
此次臨床試驗，共入組和回輸20名復發或難治性(R/R) T-ALL/T-LBL患者，其中包含14名R/R T-ALL患者及6名R/R T-LBL患者。3名患者為Ph陽性或ETP-ALL高危亞型；11名患者存在高危突變或基因融合。5名患者在入組前接受過移植。患者接受了中位數為4.5線的治療。入組時，17名患者的骨髓腫瘤細胞比例中位數為21.49%；有3名T-LBL患者髓內未見腫瘤細胞。分別有5位T-LBL和4位T-ALL患者有髓外病灶，其中3名有中樞受累。
‖臨床產品制備及回輸
研究應用了來源于患者或其移植供者的NS7CAR產品。對于未接受過異基因移植的患者，使用自體CAR-T細胞；對于入組時為移植后復發狀態的患者，在對患者進行綜合評估后確定使用患者自體或移植供者來源的CAR-T細胞。所有患者的NS7CAR產品均成功制備（自體來源，n=18；供者來源，n=2），中位轉染效率為95.10%。NS7CAR產品有更多的CD8+亞群，中位CD4/CD8比例為0.42。在Day0，分別3、16和1名患者接受了低劑量（0.5×106/kg）、中劑量（1-1.5×106/kg）或高劑量（2×106/kg）的單次NS7CAR回輸。
‖療效及安全性
NS7CAR展現出了良好的安全性和耐受性。1名患者未出現CRS;18名患者的CRS≤2級，僅有一名患者出現3級CRS。2名患者發生1級ICANS。
同時，NS7CAR在臨床試驗中展現了令人振奮的好療效。在Day28時，16/17（94.12%）的骨髓受累患者實現了MRD陰性完全緩解；3名僅有髓外病灶的T-LBL患者也繼續保持了髓內CRi的狀態。在9名有髓外病灶的患者中，5名在中位時間29天時達到髓外CR。兩名有巨大縱隔腫物（>7cm）的患者在第29天分別達到髓外部分緩解（PR）和疾病穩定（SD），其中PR患者在第104天時，其髓外病灶進一步縮小。兩名有中樞神經系統浸潤的患者也分別在第15天和第28天達到CR。
至研究截止日期（2021年10月25日），患者的中位隨訪時間為142.5天，最長達311天。6/20名患者在CAR-T細胞回輸后未接受額外的抗白血病治療或移植，其中4人在54天的中位時間保持無疾病進展。在回輸后中位時間57.5天，10名CR患者接受了鞏固性橋接移植；移植后中位隨訪時間為210天，7/10名CR患者在移植后保持MRD陰性并持續生存。兩名患者因個人原因出組，出組時均處于CR。一名患者進行了二次移植，發展為3級aGvHD，隨后去世。有4名未達到CR或CR后復發的患者接受了挽救性移植并全部達到CR。
‖NS7CAR的細胞動力學
NS7CAR擴增起始于回輸后中位數4.5天。CAR中位峰值拷貝數為1.37×105copies/μg DNA，達到峰值的中位時間為19天。在末次隨訪時，NS7CAR+DNA中位持續時間為90天；在移植后中位時間39.5天，12/14名患者仍可通過qPCR檢測到水平較低的NS7CAR+DNA。對于未橋接移植的6名患者，CAR-T細胞在末次隨訪中仍可檢測到，中位持續時間為48.5天。用流式檢測的NS7CAR中位峰值比例為67.76%，最高比例達84.71%；中位峰值時間為17天。
NS7CAR回輸后，患者外周血中惡性和正常CD7+細胞的最顯著減少發生在回輸后中位時間第7天。在CAR-T擴增高峰，每位患者的T/B/NK細胞（不包括CAR+ 和白血病T細胞）的絕對數量均顯示出不同程度的短暫下降。NS7CAR迅速消滅了CD7+細胞，并主要保留了CD7陰性細胞亞群。T/B/NK細胞隨后恢復到基線水平，但就如所預期的，在移植后不久出現下降。在移植后，正常的CD7+T細胞和NK細胞得到充分恢復。
‖總結
該研究揭示了通過"自然選擇"機制生產靶向CD7 CAR-T細胞的方法(NS7CAR)。研究者發現，雖然流式無法檢測到NS7CAR-T細胞表面上的CD7分子，但NS7CAR-T細胞繼續表達CD7mRNA和蛋白質的水平雖然稍低，但與正常對照T細胞中的水平是可比的。研究認為，NS7CAR-T細胞的CD7分子很可能被CD7CAR抗原掩蓋或在胞內隔離，大大減少了NS7CAR-T的表面CD7抗原，避免了CAR-T細胞之間的大量自相殘殺。不能排除在體外"自然選擇"過程中，少部分NS7CAR-T細胞從自相殘殺中出現的可能性。這使得NS7CAR-T與真正的CD7陰性的Neg7CAR-T或KO7CAR-T細胞形成對比。研究者提出，許多NS7CAR-T細胞本身并不是CD7陰性，而是功能性CD7陰性。
因此，研究者提出假設：由于CAR信號可能需要蛋白質復合物形成，CAR-T細胞通過NS7CAR-T細胞表面的游離CD7CAR與靶向T細胞上表達的CD7之間的相互作用被激活，而胞內CD7-CD7CAR復合物不能激活T細胞。與Neg7CAR和KO7CAR細胞相比，細胞內CD7CAR-CD7相互作用是否導致CAR信號減弱,并導致NS7CAR細胞體外擴增程度降低仍待確定。其次，自相殘殺是否在NS7CAR減少擴增中發揮了作用還有待進一步研究。
在NS7CAR中，存在顯著更多的CD8+中央記憶CAR-T細胞，這種CD8偏向性可能提供更持久的疾病控制。由于NS7CAR的產生不涉及額外的基因編輯，避免了脫靶效應的潛在風險。因此，NS7CAR的生物學特性和其生產的便捷十分有利于其臨床應用。
迄今為止，針對T細胞惡性血液腫瘤的靶向CD7 的CAR-T療法僅有有限的臨床試驗和病例報告。NS7CAR可由患者或供者的外周血制備，中位轉染率大于95%，且細胞活性率約90%。由T系惡性血液腫瘤患者制備的自體CAR-T細胞的主要安全顧慮是細胞終產品中的惡性細胞污染。根據每個患者循環腫瘤細胞的表型，使用CD3或CD4/CD8選擇加上NS7CAR的體外 "自然選擇 "以及強大的抗白血病活性，可以成功地排除NS7CAR制備中的惡性細胞。
在該臨床試驗中，幾乎所有患者在第28天時都達到了MRD陰性的CR。大部分有髓外病灶的患者，包括中樞神經系統白血病患者或彌漫性髓外受累的患者，也都能達到髓外CR。兩名有巨大縱膈腫塊的患者分別達到了PR和SD。對于有巨大腫塊的患者來說，可能需要更長的時間及聯合治療來實現CR，因為根據PET-CT評估，處于PR的患者在第104天發現有進一步的臨床改善。
入組該臨床試驗的患者曾接受了大量的既往治療。鑒于CD19 CAR-T治療的B-ALL患者復發率較高，而且T-ALL/LBL比一般B-ALL更具侵略性，該研究允許在緩解后進行鞏固性異基因造血干細胞移植。共有10名骨髓和髓外CR患者進行了鞏固性異基因造血干細胞移植，這可能限制對于NS7CAR-T單藥治療的持續性的評估。盡管如此，在中位隨訪時間超過4.5個月（最長10個月）的情況下，NS7CAR回輸后再進行異基因造血干細胞移植組沒有觀察到復發現象。在6名沒有接受移植的CR患者中，有4名在最后一次隨訪時仍保持CR（中位時間1.5個月，最長6個月）。然而，在一些未達到CR或復發的患者中，觀察到CD7靶點丟失。
STIL-TAL1融合基因與較高的復發率和較差的預后有關，發生在高達約25%的T-ALL患者中。在這一研究中，所有3名STIL-TAL1融合基因的患者預后都較差，有1名NR和2名早期復發，表明單獨使用CAR-T療法可能無法扭轉其臨床結局。一旦這類患者從CAR-T中獲得CR，應在治療過程的早期考慮進行移植。
NS7CAR-T細胞的擴增在中位第19天達到峰值，截至最后一次隨訪時，可檢測到NS7CAR-T細胞持續存在長達195天。12/14名患者在移植后中位隨訪時間1.2個月（最長4.9個月）時，仍可通過qPCR檢測到低水平的NS7CAR-T。
NS7CAR表現出卓越的安全性，在大多數患者中只有輕微的CRS，沒有嚴重的神經毒性。在該臨床研究方案中，早期應用托珠單抗干預管理，有可能降低嚴重CRS的發生。這種早期干預和管理可能在減少CRS方面發揮了作用。
兩名曾有異基因造血干細胞移植史的患者在回輸時使用了來自移植供者的CAR-T細胞，其中一位出現了輕微的皮膚排異反應。因此，應特別關注此類患者。14名患者中有7名接受了后續的異基因造血干細胞移植，包括其中2名第二次移植的患者出現了GvHD。雖然在這7名回輸后出現GvHD的患者中仍可檢測到極低水平的CAR-T細胞，但是不太可能是導致GvHD的原因。
小結
在該研究中，NS7CAR在體外和體內均表現出強大的抗腫瘤作用。NS7CAR的首次人體臨床試驗表明，無需額外的基因編輯即可防止CD7表達，并成功生產NS7CAR-T細胞。總體而言，NS7CAR對治療R/R T-ALL/LBL是安全且高效的。
